全能学霸 作者:小啊小提莫

    第422章多分子克隆

    全能学霸 作者:小啊小提莫

    第422章多分子克隆

    到了三级文明，有关克隆，已经研究到了分子水平，也就是分子克隆！

    什么是分子克隆呢？

    在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

    分子克隆是指分离一个已知DNA序列，并以in vivo(**内)方式获得许多复制品的过程。这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因，但也可用来增加某些任意的DNA序列，如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的DNA片断。

    将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和A克隆两类。

    A克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(A)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一A反映一种mRNA的结构，A克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是:

    有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用A克隆;

    A克隆易筛选，因为A库中不包含非结构基因的克隆，而且每一A克隆只含一个mRNA的信息;

    A能在细菌中表达。A仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。

    那么，如何做到这一点呢？

    首先是dna片段的制备！

    常用以下方法获得DNA片段:①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段;②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段;③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段;④从mRNA反转录产生A。

    其次是载体dna的选择，这里要知道，什么是质粒。

    质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状。大小为1200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是‘紧密型‘;二是‘松弛型‘。此外还应具有分子量小，易转化。有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，A库和次级克隆。

    柯斯(Cos)质粒是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。

    而噬菌体dna。常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和A库。

    M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主复制，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体。又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。

    接着是dna载体的连接。

    DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有:①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高;③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接。在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。

    连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时。形成环状分子，比率常为1∶1。

    最后是引入寄主细胞。

    常用两种方法:①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低。原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。

    此时的李安，操控着墨莲人，不断的收集材料，进行着研究。

    三级文明，分子克隆有很多的作用！

    分子克隆技术是发展起来的不久，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。

    利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌。利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。

    通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞。发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。

    通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞。发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。

    植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。

    一个有关于李安的躯体正在不断的形成......

    “这是一个多顺反子，在这里，在这里！为了自己的身体变得完美！”

    既然是建造自己的身体，李安尽量让自己变得完美。

    在原核细胞中，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开，这种mRNA叫做多顺反子mRNA。顺反子的概念来自遗传学中的顺反重组试验，是确定交换片段究竟在一个基因内还是属于两个基因的试验，简言之。一个顺反子就是一个基因，多顺反子就是多个基因。真核生物中也有多顺反子，比如s共有13500个基因，约25%的是多顺反子。

    mRNA存在于原核和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器(如线粒体和叶绿体)中。RNA病毒和RNA噬菌体中的RNA既是遗传信息的载体又具有mRNA的功能。生物体mRNA种类的多少与生物进化水平有关，高等生物所含的遗传信息多，mRNA的种类也多。生物体内某种mRNA的含量根据需要而有不同，如5龄蚕后部丝腺体的主要任务是快速合成大量丝心蛋白，因而编码丝心蛋白的mRNA含量特别多。有些细菌需要不断多顺反子适应外部环境，其体内编码某些诱导酶的mRNA的含量也较多。

    原核和真核生物mRNA有不同的特点:①原核生物mRNA常以多顺反子(见)的形式存在，即一条mRNA链编码几种功能相关联的蛋白质。真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在。即一种mRNA只编码一种蛋白质。②原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的，即转录尚未完毕，蛋白质的转译合成就已开始。真核生物转录的mRNA前体则需经后加工，加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始。工作信息体中蛋白质与RNA之比约为3。③原核生物mRNA半寿期很短，一般为几分钟，最长只有数小时(RNA噬菌体中的RNA除外)。真核生物mRNA的半寿期较长，如胚胎中的mRNA可达数日。④原核与真核生物mRNA的结构特点也不同。

    一级结构与功能的关系:原核生物mRNA一般5端有一段不翻译区，称前导顺序，3端有一段不翻译区。中间是蛋白质的编码区，一般编码几种蛋白质。如大肠杆菌乳糖操纵子mRNA编码3条多肽链;色氨酸操纵子mRNA编码5条多肽链。也有单顺反子形式的细菌mRNA，如大肠杆菌脂蛋白mRNA。原核生物mRNA分子中一般没有修饰核苷酸，也没有5端帽子结构和3端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mRNA的起始密码子(AUG)附近(5方向上游)的一小段长短不等的顺序，含有较多的嘌呤核苷酸，被称为SD顺序。

    第422章多分子克隆

    第422章多分子克隆